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C1q放射免疫测定法

心得 (0)

实验试剂

CFD稀释液(即VBS),10%三氯醋酸,C1q溶液

实验设备

PEG(MW6 000),离心机

实验步骤

1. C1q标记法C1q的同位素标记,一般用125I,也可用131I。

125I的标记有两种方法,即氯胺T法和乳过氧化物酶法。下面介绍氯胺T法:
   1) 在100μl C1q(1mg/ml)中,加入100μCi125I,混匀,然后加入25μl 0.4mol/L PB(pH值7.4,含1mg氯胺T),冰浴中搅拌4~6min;

   2) 立即加入50μg/μl偏重亚硫酸钾中止反应,再加入50μl 1%牛血清白蛋白作为载体蛋白;

   3) 过Sephadex G25柱(20cm×0.5cm,预先用pH值7.4、0.4mol/L PB平衡,并注入1ml 1%牛血清白蛋白),以与游离125I 分开;

   4) 以适当浓度分装后,放-70℃保存。为减少自身凝集,加入0.02%Tween20。

2. 取标记好的C1q,用CFD稀释到1mg/ml。

3. 7 000r/min离心30min(4℃),除去不溶性凝聚蛋白,上清液存放于4℃。

4. 取试管4支,每管加测定血清0.2ml,CFD 0.2ml,标记C1q 50μl(1μg/ml)。1、2管为测定管,3、4管为对照管。

5. 摇匀后,放25℃温箱60min,取出再放4℃冰箱60min。

6. 各管加3ml PEG,最终浓渡为2.5%,摇匀后,放4℃ 2h。

7. 3、4管加10%三氯醋酸,沉淀所有的蛋白。将4个管都以1 000r/min离心20min,去上清液,沉淀物放γ计数器内测cpm。

8. 计算

B=(a加b2加c加d2)×100

B:标记C1q结合量(%)。a、b:1、2管(测定管)cpm。c、d:3、4管(对照管)cpm。

问答 (17)

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