作者：王涛 ，戴明珠，李延川，彭逸，李春启
作者单位：无限极（中国）有限公司；杭州环特生物科技股份有限公司
本文发表于：《中国实验动物学报》2022年1月30日
核心摘要 ：
目的：通过体外细胞和体内斑马鱼实验，快速评价复方中药提取物增强免疫力作用，并进行初步机制研究。
方法：在体外实验中利用 RAW 264.7 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞初步评价复方中药提取物的生物活性；再以酒石酸长春瑞滨诱导建立斑马鱼活体免疫低下模型，分别从斑马鱼巨噬细胞生成和吞噬功能、T细胞生成及相关炎症、免疫基因的表达等多个方面，观察复方中药提取物的干预作用。
结果：体外实验中复方中药提取物有良好的生物安全性，其在250 μg/mL 条件下可提高酒石酸长春瑞滨诱导后的RAW 264.7 小鼠单核巨噬细胞存活率。体内研究表明，复方中药提取物在 222、667、2000 μg/mL 浓度时均可明显改善长春瑞滨诱发的斑马鱼巨噬细胞数量的减少，同时增强巨噬细胞吞噬能力；222、667μg/mL浓度可显著增加T细胞荧光强度；222、667、2000 μg/mL 浓度均可明显恢复模型对照组中rag1、rag2 基因相对表达量被下调的情况，并均可以显著下调模型斑马鱼TNF-α 基因相对表达量；复方中药提取物222μg/mL可显著上调免疫因子 IL-12 基因表达量，在2000μg/mL 时显著上调IFN-γ 基因表达量。
结论：体内、外实验表明复方中药提取物具有明显的增强免疫力作用。
● 综述
免疫力可以保护机体不受侵害，近年来，由于生态失衡所导致的免疫性疾病越来越多，西药不能起到预防作用，治疗效果不甚明显且存在毒副作用。而中药及其提取物在中医药基础理论指导下，擅治未病，讲究协调和平衡，且毒副作用小，所以中药及其提取物增强免疫力一直是新研究方向。已有实验研究表明，灵芝多糖和生物碱均能明显增强小鼠巨噬细胞吞噬能力和 T 淋巴细胞转化能力，同时可提高小鼠外周血中 IFN-γ 的表达水平。五味子多糖、白术多糖及内酯均具有抗氧化和增强机体免疫力活性；菟丝子提取物是有效的抗菌剂，抗氧化剂和抗炎剂；党参和茯苓在多种急性和慢性炎症的不同实验模型中显示抗炎活性。然而大部分研究都是以传统的大小鼠为动物模型进行评价，具有造模时间长、成本高、通量小等缺点。
斑马鱼是一种国际认可的新型模式生物，其引人注目的优势是胚胎发育的透明性，基于高通量的检测体系，以及短时-高效-低费筛选。随着“3R原则”的推行与实施，其在药物的靶点鉴别、疾病的模型开发和毒性评价中应用越来越广泛。本研究采用体外细胞实验和体内斑马鱼免疫低下模型探究复方中药提取物对免疫力的影响，从RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞活性，斑马鱼巨噬细胞数量及其吞噬功能，T细胞数量，免疫相关基因水平多方面考察复方中药提取物的生物安全性与增强免疫作用，对复方中药提取物增强免疫功能进行验证并提供理论依据。
● 实验方法
1. RAW264.7细胞培养及复方中药提取物处理
取生长状态良好的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，每孔依次加入复方中药提取物62.5、125、250、500及1000μg/mL浓度的培养基，测定各孔吸光度（OD）值，确定复方中药提取物处理浓度；
除正常对照孔及溶剂对照孔（0.1%DMSO）外，其余每孔均加入12.5μg/mL浓度的培养基后，再依次加入复方中药提取物27.8、83.3、250μg/mL浓度以及阳性对照组25μg/mL浓度的培养基，测定各孔OD值，评价复方中药提取物对RAW264.7细胞存活率的影响。
2. 复方中药提取物安全性考察
选取受精后2dpf的Tg（mpeg1：EGFP）转基因斑马鱼，设置加药组：复方中药提取物62.5、125、250、500、1000、2000μg/mL；同时设置正常对照组。记录孵育至 6 dpf 时斑马鱼各脏器毒性表型与死亡情况，确定复方中药提取物对正常斑马鱼的检测浓度（MTC）。
3. 复方中药提取物对斑马鱼巨噬细胞生成的影响
取2dpf的Tg转基因斑马鱼，设置加药组：复方中药提取物222、667、2000μg/mL；同时设置对照组，建立斑马鱼巨噬细胞减少症模型。在荧光显微镜下观察斑马鱼尾部静脉血管中巨噬细胞荧光强度（S1），并拍照。
4. 复方中药提取物对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的影响
选取2dpfTg转基因斑马鱼，均静脉注射红色荧光微球作为异物以建立斑马鱼巨噬细胞吞噬功能模型。将模型斑马鱼设置加药组：复方中药提取物 222、667、2000 μg/mL；同时设置对照组，在荧光显微镜下观察斑马鱼体内（全身）荧光微球残留的数目（N）。
5. 复方中药提取物对斑马鱼 T 细胞的影响及初步机制研究
选取2dpf Tg转基因斑马鱼，设置加药组：复方中药提取物 222、667、2000 μg/mL；同时设置对照组：阳性对照百令胶囊 60.0 μg/mL，正常对照组及模型对照组，建立斑马鱼 T 细胞减少症模型。
在荧光显微镜下观察斑马鱼 T 细胞荧光强度（S2），分析对 T 细胞生成的影响；收集斑马鱼样本，提取各浓度组斑马鱼总 RNA，以 β-actin 作为基因表达的内参，检测目的基因肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、重组激活型基因-1（rag1）、重组激活型基因-2（rag2）、白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和 γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）的转 录 水 平 ， 进 行 复 方 中 药 提 取 物 增 强 免 疫 力 初 步 机 制 研 究。
● 实验结果
1. 复方中药提取物对 RAW 264.7 细胞存活率的影响
当复方中药提取物浓度为62.5~250μg/mL时，RAW264.7细胞存活率均>90.0%；当复方中药提取物浓度为500μg/mL时，RAW264.7 细胞存活率下降为 84.0%。故确定复方中药提取物对RAW264.7细胞安全浓度为250μg/mL（见表1）。
由表2可知，酒石酸长春瑞宾可导致RAW264.7细胞存活率显著下降；同时复方中药提取物3倍浓度梯度干预后，细胞存活率呈剂量依赖性升高，复方中药提取物250μg/mL可显著提高RAW264.7细胞存活率（P<0.01）。
2、复方中药提取物对斑马鱼的 MTC
在实验终点，复方中药提取物62.5~2000μg/mL浓度组斑马鱼均未见明显异常，各脏器和行为状态与正常斑马鱼相似（见图1）。提示复方中药提取物对正常斑马鱼的MTC为2000μg/mL。
3. 复方中药提取物对斑马鱼巨噬细胞生成的影响
由统计结果可知（表3，图2），酒石酸长春瑞宾可导致斑马鱼免疫力低下，表现为与正常对照组比较，酒石酸长春瑞宾组斑马鱼中巨噬细胞荧光强度显著降低；复方中药提取物低、中、高3倍浓度梯度干预后，巨噬细胞荧光强度均显著升高，巨噬细胞减少的改善功效分别为18%（P< 0.05）、21%（P<0.01）和22%（P<0.01）。
4、复方中药提取物对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的影响
由统计结果可知（表 4，图 3），与模型对照组比较，复方中药提取物低、中、高3个浓度组均可明显减少斑马鱼体内荧光微球残留数目（P<0.05），表明复方中药提取物具有促巨噬细胞吞噬功能作用。
5. 复方中药提取物对斑马鱼 T 细胞生成的影响
由统计结果可知（表5，图4），与正常对照组比较，模型对照组T细胞荧光强度极显著降低，表明酒石酸长春瑞宾可诱导斑马鱼免疫抑制。与模型对照组比较，复方中药提取物中浓度T细胞荧光强度显著升高（P<0.01）；但高浓度对T细胞荧光强度无升高作用且呈现降低的作用趋势。
6、复方中药提取物对斑马鱼 T 细胞的影响及初步机制研究
6.1 RNA 浓度及纯度
在实验终点，提取斑马鱼总RNA，测定 RNA 浓度及纯度，结果表明 A260/A280比值均在1.88~2.03之间，表明提取得到斑马鱼总RNA质量较好，可用于后续q-PCR 实验（见表6）。
6.2 对重组激活型基因rag1和rag2的影响
根据基因相对表达量公式计算，与正常对照组比较，模型对照组 rag1、rag2 基因相对表达量均显著下调（P<0.01），复方中药提取物干预后，低、中、高浓度组rag1、rag2基因相对表达量均显著恢复（见表7）。
6.3 对免疫因子 IL-12 和 IFN-γ 的影响
与正常对照组比较，模型对照组 IL-12 基因相对表达量极显著下调（P<0.001），复方中药提取物干预后，在实验终点，低浓度组 IL-12 基因相对表达量极显著上升（P < 0.001），中、高浓度组出现负反馈调节。
与正常对照组比较，模型对照组 IFN-γ 基因相对表达量显著下调（P<0.01），复方中药提取物3倍浓度梯度干预后，IFN-γ 基因相对表达量呈剂量依赖性恢复，复方中药提取物高浓度组 IFN-γ 基因相对表达量极显著上升（P <0.001）（见表8）。
6.4 对致炎症因子 TNF-α 的影响
模型对照组TNF-α基因相对表达量（1.000）与正常对照组（0.006）比较极显著上调（P<0.001）。复方中药提取物低、中、高浓度组 TNF-α 基因相对表达量分别为 0.023、0.002 和 0.008（P<0.001），提示复方中药提取物可显著下调 TNF-α 基因相对表达量（见表 9）。
● 结论
在体外实验中复方中药提取物有良好的生物安全性，且可明显提高酒石酸长春瑞滨诱导后小鼠单核巨噬细胞的存活率。体内研究表明，复方中药提取物可明显改善长春瑞滨诱发的斑马鱼巨噬细胞及T细胞数量的减少，同时增强体内巨噬细胞的活性和吞噬能力；复方中药提取物可明显恢复模型对照组中rag1、rag2 基因相对表达量被下调的情况，复方中药提取物上调免疫因子 IL-12 的表达量、IFN-γ 基因的相对表达量，复方中药提取物可显著下调 TNF-α 基因相对表达量。体内、外实验表明复方中药提取物具有明显的增强免疫力作用。
综上所述，复方中药提取物具有明显的抗炎及增强免疫力的作用。本研究可为复方中药提取物作为新的免疫保健食品和二次开发提供指导性依据。