巨噬细胞来源的泡沫细胞形成是动脉粥样硬化斑块的标志，RNF128 作为一种膜定位的泛素连接酶，其在动脉粥样硬化中的作用未知；SRB1在巨噬细胞中的作用存在争议，且其泛素化修饰对oxLDL内吞的调控机制有待探索。2025年3月4日，山大齐鲁医院张澄、张猛教授联合山大基础医学院高成江教授在Nature Communications (IF 14.7) 发表文章“E3 ubiquitin ligase RNF128 promotes Lys63-linked polyubiquitination on SRB1 in macrophages and aggravates atherosclerosis”。研究发现RNF128可通过促进巨噬细胞中SRB1的K63连接的多聚泛素化加重动脉粥样硬化，为动脉粥样硬化的治疗提供了潜在的新靶点。

病毒产品

AAV-PCSK9

实验动物

6周龄RNF128^fl/flLyz2^cre和RNF128^fl/fl小鼠

注射方式

静脉注射

建模方法

西方饮食（WD）喂养，持续 20 周

敲除RNF128能减轻AAV-PCSK9诱导的小鼠动脉粥样硬化

1.巨噬细胞特异性缺失RNF128通过减少脂质摄取来减弱泡沫细胞的形成

研究发现在小鼠和人类的动脉粥样硬化病变中，RNF128蛋白水平随病变进展而升高，且受脂质积累驱动。通过siRNA沉默野生型小鼠巨噬细胞中RNF128基因，发现RNF128缺失的巨噬细胞在oxLDL存在下，泡沫细胞形成减少，细胞总胆固醇含量也低于对照组。构建巨噬细胞特异性RNF128 敲除小鼠（RNF128-CKO），该小鼠来源的巨噬细胞在oxLDL处理后，脂质积累减少。同时，过表达RNF128则促进野生型巨噬细胞脂质积累。摄取实验及胆固醇流出检测发现，RNF128主要通过调节脂质摄取促进泡沫细胞形成。构建缺乏RING结构域的RNF128催化失活突变体（Flag-RNF128 ΔR），发现过表达野生型RNF128可恢复RNF128-CKO小鼠巨噬细胞中减少的脂质积累，而Flag-RNF128 ΔR 则不能；且RNF128增强 oxLDL 摄取依赖于RING 结构域，说明巨噬细胞靶向缺失 RNF128 通过减少oxLDL摄取减弱脂质积累。进一步研究分析证明RNF128缺乏下调SRB1蛋白水平并影响泡沫细胞形成。

2.SRB1参与RNF128对泡沫细胞形成的影响

数据表明RNF128影响SRB1蛋白稳定性，使用溶酶体功能抑制药物处理 RNF128缺陷的巨噬细胞，SRB1蛋白水平的下降受到显著阻止；而蛋白酶体抑制剂对SRB1表达无影响，说明RNF128通过抑制SRB1的溶酶体蛋白降解来上调其蛋白水平。进一步分析证实RNF128通过E3连接酶活性稳定SRB1。在 RNF128基因敲除的巨噬细胞中过表达SRB1，发现其对Dil-oxLDL的摄取能力增强，脂质积累也得到恢复。CoIP实验发现RNF128与SRB1蛋白存在相互作用，将RNF128截短为多个片段进行CoIP分析，发现除全长RNF128外，RNF128-ΔR、RNF128-N和RNF128-ΔC也能与SRB1相互作用，表明N端对结合至关重要。由于信号肽是蛋白转运的重要组成部分，构建缺失PA结构域的RNF128突变体（RNF128-ΔPA）和仅含PA结构域的重组质粒（RNF128-PA），结果显示RNF128因PA结构域缺失失去与SRB1的结合能力，而RNF128-PA可有效结合SRB1。通过探究RNF128 对SRB1的泛素化修饰作用，发现RNF128能催化SRB1在赖氨酸478位点的K63连接的多聚泛素化。此外，RNF128介导的SRB1泛素化促进其通过Rab11再循环到膜上。

3.巨噬细胞特异性缺失RNF128改善小鼠动脉粥样硬化

最后，研究团队研究了巨噬细胞特异性敲除RNF128对小鼠动脉粥样硬化的影响。将 RNF128 条件性敲除小鼠（RNF128^fl/flLyz2^cre）与ApoE^-/-小鼠杂交，构建动脉粥样硬化模型。喂食西方饮食（WD）20 周后，发现敲除RNF128的ApoE^-/-RNF128^fl/flLyz2^cre小鼠与对照组小鼠相比，动脉粥样硬化病变面积显著减小，主动脉根部病变面积在雄性和雌性小鼠中分别减少约 23% 和 32%。免疫荧光染色显示，敲除RNF128可降低动脉粥样硬化斑块中SRB1的表达，免疫组化检测发现斑块内炎症细胞因子 TNFα、IL1β 和 IL6 显著减少，Masson染色表明敲除组小鼠斑块中胶原蛋白含量增加，说明RNF128抑制不仅减缓动脉粥样硬化发展，还使斑块表型更稳定。进一步将AAV-PCSK9 静脉注射RNF128^fl/flLyz2^cre和RNF128^fl/fl小鼠，构建LDLR缺陷小鼠模型。结果显示在雄性和雌性小鼠中，敲除 RNF128 均能减轻动脉粥样硬化，进一步验证其抗动脉粥样硬化作用。通过构建携带巨噬细胞特异性启动子的 AAV，分别对ApoE^-/-RNF128^fl/fl小鼠和ApoE^-/-RNF128^fl/flLyz2^cre小鼠进行处理。结果显示，RNF128 缺陷可改善动脉粥样硬化，而在ApoE^-/-RNF128^fl/flLyz2^cre小鼠中给予巨噬细胞SRB1则促进主动脉和主动脉根部的斑块形成，表明SRB1是RNF128促动脉粥样硬化作用所必需的。

本研究揭示了RNF128在泡沫细胞形成中的作用，且其在小鼠和人类中与动脉粥样硬化的正相关关系。巨噬细胞特异性敲除RNF128的ApoE^-/-小鼠，其动脉粥样硬化的发展在雄性和雌性中均得到改善；在由PCSK9诱导的LDLR缺陷小鼠中也观察到了相似现象。机制上，首次发现了RNF128与SRB1之间的直接相互作用，RNF128促进SRB1在赖氨酸478位点发生Lys63（K63）连接的泛素化，这促进了Rab11介导的SRB1向细胞膜的回收，并促进了oxLDL的内吞过程。因此，巨噬细胞会积累脂质并加剧炎症，进而形成泡沫细胞。因此对巨噬细胞RNF128进行适当干预具有潜在的治疗意义。