肠出血性大肠杆菌O157核酸检测试剂盒（PCR-荧光探法）

肠出血性大肠杆菌 O157 核酸检测试剂盒（一管式 PCR-荧光探针法）

◆ 产品说明

致病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩

增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于肠出血性大肠杆菌 O157 的检测。检出限为 10

3 CFU/ml。

◆ 产品组成（96 测试）

试剂 含量

A-O157-P 20μL × 8 管× 12 排

NG-P 100μl× 3 支

PG-O157-P 100μl× 2 支

◆ 适用仪器

ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600 等实时荧光 PCR 仪。

◆ 自备耗材和仪器

①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属

浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

1）第一区：样本制备区。

2）第二区：模板添加区。

3）第三区：扩增及产物分析区。

★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心 30

秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

◆ 样品处理

参照 《GB/T 4789.36-2008 食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌 O157：H7/NM 检验》中的 5.1 处理样品，对

样品进行前增菌，制备的菌液保存待用。

样品采集后应尽快检验。若不能及时检验，可在 2℃~4℃保存 18h。以无菌操作取检样 25g（ml）加入到含有

225ml mEC+n 肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质 1min~2min；或放入盛有 225ml mEC+n 肉汤的均质杯

中，8000 rpm/min～10000 rpm/min 均质 1min~2min, 于 36 ℃±1℃培养 18h~24h。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

1. 模板制备（样本制备区）

请于-20℃条件下保存，有效期 12 个月

SM-011052M-A02

2

建议使用试剂配套细菌组 DNA 提取系列产品，具体过程详见产品说明书。

2．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）

剪下所需测试数的已含有反应液的 PCR 管，放置在室温待解冻后，离心 30 秒后揭开封口膜，向每管反应液

中分别加入 5μL 模板，顺序为 NG、待测样品模板、PG-O157-P。盖好配套的 PCR 管盖后，涡旋混匀 30s，离心 1min，

立即进行 PCR 扩增反应。

3. 扩增反应（扩增及产物分析区）

使用荧光定量 PCR 仪，荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 TAMRA。

按下列条件设置扩增反应：

PCR 循环 荧光收集位点

95℃ 3 分钟 1 个循环 —

94℃ 5 秒

40 个循环

—

60℃ 40 秒 ※

4.基线和阈值设定

基线调整取 3-15 个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。

◆ 结果判定

检测样品无 Ct 值或≥40.0，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有肠出血性大

肠杆菌 O157 或含量低于检测限；

检测样品 Ct≤35.0，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有肠出血性大肠杆菌 O157；

检测样品 35.0＜Ct＜40.0，需进行一次重复实验，若 Ct 值≥40.0 则为阴性，否则为阳性。

★ NG 反应为平滑直线，PG 反应为“S”型扩增曲线且 Ct 值＜30，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请

与技术支持人员联系。