糖基化是最常见的翻译后修饰（PTMs）之一，广泛存在于膜蛋白、分泌蛋白、细胞因子乃至治疗性抗体等关键生物大分子中。N-糖基化和O-糖基化在蛋白质折叠、稳定性、细胞识别与信号转导中发挥重要作用。其改变常常与肿瘤、免疫疾病、神经退行性病变等多种病理状态密切相关。然而，由于糖基化修饰种类繁多、异构体复杂，Bottom-Up蛋白质组学策略通过酶切蛋白后仅能获得局部肽段信息，难以重构完整糖蛋白的修饰模式。因此，本文将为您解析如何用Top-Down蛋白质组学分析糖蛋白修饰？

一、Top-Down蛋白质组学：解析糖蛋白异构体的有力工具

Top-Down蛋白质组学采用高分辨率质谱直接分析完整蛋白分子，保留所有天然存在的糖基化位点和异构形式。该方法可一次性识别特定蛋白的多个糖型组合，实现糖蛋白修饰的原位表征、异构体解析和定量分析。

二、实验流程

1、样品准备

（1）富集糖蛋白或糖肽：可采用亲和层析（如 lectin 富集、hydrazide chemistry、boronic acid 等）选择性富集糖蛋白。

（2）去糖酶处理（可选）：如 PNGase F（裂解 N-糖），用于比较分析是否存在糖基化修饰。

（3）脱盐与浓缩：提高质谱信号质量。

2、质谱分析

（1）使用高分辨率质谱仪（如 Orbitrap 或 FT-ICR）进行 Top-Down 分析。

（2）常用离子碎裂方式：

① ETD（Electron Transfer Dissociation）/ECD（Electron Capture Dissociation）：保留糖链，适合识别糖基化位点。

② HCD（Higher-energy C-trap Dissociation）/CID（Collision-Induced Dissociation）：易碎糖链，不易保留糖结构信息，但可提供肽段信息。

3、数据分析

（1）使用专门用于 Top-Down 的软件工具，如：ProSight PTM / ProSight Lite，TDPortal，TopPIC / TopMG。

三、Top-Down蛋白质组学与 Bottom-Up 方法的核心差异

1、Bottom-Up：通过胰蛋白酶等酶切获取肽段；糖链容易被部分或全部切除，位点识别困难，异构体混淆严重；

2、Top-Down：直接检测糖修饰在完整蛋白上的分布和组合，保留真实的结构信息，适合精细解析复杂修饰状态。

四、Top-Down蛋白质组学分析糖蛋白的技术实现路径

1、样品预处理与脱糖/保糖策略

根据研究目的，可选择保留完整糖链，或使用PNGase F等酶部分去糖以提高谱图清晰度。百泰派克生物科技已建立多套糖蛋白前处理流程，适配不同分析目标。

2、高分辨率质谱平台

如 Orbitrap 或 FT-ICR MS，配合 ETD/EThcD 等碎裂方式，可在保留糖基修饰的同时进行结构解析，实现糖型分布与位点信息的同步获取。

3、数据解析与糖型数据库匹配

Top-Down 数据需搭配专业算法进行解卷积与异构体识别，如 ProSight、TDPortal、MSPathFinder 等。结合糖基化专属数据库（GlyConnect, UniCarbKB）可提升识别准确性。

五、Top-Down 糖蛋白质谱的价值体现

1、抗体药物结构表征

单克隆抗体如IgG具有多个糖基化位点，其糖型变化直接影响抗体亲和力、免疫原性和半衰期。Top-Down 可一次性识别不同糖基组合的IgG异构体，为抗体药物研发与质量控制提供结构依据。

2、癌症糖生物标志物研究

肿瘤相关糖基化变异（如核心岩藻糖化、唾液酸化）可通过Top-Down 检测特定糖型的表达模式，发现潜在早期诊断标志物。

3、神经系统疾病中的糖修饰异常

如阿尔茨海默病相关的糖蛋白 Tau，其糖基化状态变化可影响其聚集行为。Top-Down蛋白质组学能清晰识别不同修饰形式的 Tau 异构体，为疾病机制解析提供新视角。

六、面临的挑战与应对策略

尽管Top-Down蛋白质组学在糖蛋白研究中前景广阔，但仍面临一些技术挑战：

1、高丰度蛋白分析较容易，低丰度糖蛋白仍需靶向富集

2、糖链本身易碎，碎裂方式需精心优化

3、数据分析算法与谱图库尚不完善

七、策略建议

1、如果重点是糖链结构组成，可结合 Bottom-Up 方法进行补充。

2、可结合中间层级的 Middle-Down 策略（部分酶解）以平衡分辨率与可解析度。

3、实验设计中应明确目标（定性、定位、定量或结构表征）以优化方法选择。

在百泰派克生物科技，我们整合高灵敏质谱平台、多维分离手段与自主优化的数据分析流程，为客户提供从样本预处理、谱图采集到糖型注释的一站式 Top-Down 糖蛋白解决方案。

Top-Down蛋白质组学通过对完整糖蛋白的直接分析，为我们提供了前所未有的“结构全貌”视角，极大提升了糖修饰研究的精度与深度。若您正在探索糖蛋白功能、结构变异或抗体糖型的精细研究，欢迎联系我们的项目团队，了解百泰派克生物科技在 Top-Down 糖蛋白质谱领域的专业服务！

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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