蛋白质是生命活动的核心执行者，其结构与功能息息相关。科学家们长期关注蛋白质的N端测序，而对蛋白质的C端（羧基端）研究相对滞后。实际上，C端在调控蛋白质稳定性、亚细胞定位、信号传导乃至降解中都发挥作用。尤其在蛋白质翻译后修饰、非典型剪切事件及疾病标志物挖掘方面，C端信息正展现出独特价值。

那么，如何精确测定蛋白质C端？当前的技术有哪些难点，又该如何突破？本文将为你全面梳理。

一、方法

蛋白质C端测序的关键在于准确识别并富集C端肽段，目前主流策略主要包括三大类：酶切法、化学标记法和质谱直接鉴定法。

1、酶切法

通过使用羧肽酶（Carboxypeptidase）逐步从蛋白质C端剪切氨基酸残基，结合质谱监测释放的氨基酸序列，可推断原始序列。 此法优点是操作直接，适用于较短序列，但对蛋白构象和修饰敏感，效率易受限。

2、化学标记与富集法

为了在复杂样本中准确识别C端肽段，常通过化学标记增强其特异性。常用策略包括：

（1）TMPP-AcOSu标记：将TMPP（Trimethylammoniumbutyryl）化学试剂选择性修饰C端，提高质谱信号强度；

（2）固相富集法：将肽段C端与固相介质偶联，未结合部分洗脱，保留C端肽段；

（3）异源交联剂辅助捕获：通过特定交联剂（如Biotin-NHS）连接C端与亲和载体，进行拉下纯化。

这些策略提升了C端信号的检测灵敏度，适用于复杂背景下的低丰度C端肽段识别。

3、质谱直接测序法

基于高分辨质谱（如Orbitrap、FTICR或TOF）对完整蛋白或酶切肽段进行MS/MS碎裂，通过解析碎片离子信息，重建C端序列。该方法常结合数据库比对或de novo算法进行C端肽段推断，适用于未知蛋白或不依赖已有注释的样本。

此外，配合特异性酶（如LysargiNase、GluC等）设计“半特异性酶切”策略，也可有效提高C端肽段的覆盖率。

二、挑战

尽管上述技术不断发展，但C端测序仍存在一些关键性难点：

（1）C端肽段产生效率低：传统酶切法多偏向产生N端肽，C端残留肽比例较少；

（2）缺乏C端特异性酶：目前广泛使用的胰蛋白酶等酶对C端识别能力有限；

（3）C端修饰复杂多变：如酰化、异构化、环化等结构修饰干扰碎裂模式；

（4）生物样本背景复杂：易被高丰度非目标肽段干扰，导致C端信号被“掩盖”；

（5）数据分析工具不足：现有生信工具多优化于N端测序，C端识别效率偏低。

三、优化策略

为了克服上述挑战，研究人员已经提出了一些优化策略，以提高蛋白质C端测序的准确性和效率：

（1）多酶协同酶切：结合Trypsin、GluC、AspN等不同切点的酶提高C端肽段比例；

（2）引入C端富集流程：如固相提取、亲和捕获或同位素标记策略；

（3）使用高分辨质谱平台：如Thermo Orbitrap Fusion Lumos系统，大幅提升检测灵敏度；

（4）整合AI辅助数据分析：通过机器学习识别C端特征碎片，提高识别准确性；

（5）优化前处理流程：采用温和处理条件减少C端修饰或剪切过程中的损失。

蛋白质C端测序技术在揭示蛋白质结构与功能、研究翻译后修饰以及生物制药等方面具有意义。随着新方法的不断优化和技术的发展，其准确性和应用范围将得到显著提升。百泰派克生物科技提供准确且快速的蛋白质N/C端测序服务，获国家CNAS实验室认可，助力研究人员全面理解相关内容。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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