细胞培养的基本知识 操作前准备工作: 1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上; 2.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净,紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上; 3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物.分装后置-20度保存; 4.消化液(pH7.8)或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置-20度保存; 5.各种冻存的液体复温时应边摇边融化,否则有的液体(特别是培养基)容易产生沉淀. 6.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上,如有高温灭菌的应按程序来菌).至少每月一次. 7.进入操作时应注意先清洗双手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作时注意无菌台内空间层次.手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,如果数量较多,培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作,瓶与瓶之间应相隔一定的距离,开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧,开开后应用灯先烧口,然后烧盖.用完后同样操作.整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点. 复苏: 1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-37.5度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化. 2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内,约5ml左右,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养并内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养. 传代: 1.贴壁细胞: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验. 2.悬浮细胞: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度可先离心500rpm,5min后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养. 无菌操作 简要介绍：1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2. 照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋；3.手部用5％的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰；7.标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去；8.中途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。 国内细胞库统计 上海中科院细胞库，网址：www.cell.ac.cn/cellbank/homepage.htm 协和有个细胞库 中科院昆明细胞库 http://www.ctcccas.ac.cn/ 第四军医大学实验动物中心 http://www.bio-equip.com/show1manufacture.asp?manuid=fmmu 中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心) http://www.bio-equip.com/show1manufacture.asp?manuid=CCTCC 活细胞计数 1、先消化吹打使细胞尽量变成单细胞悬液； 2、取出细胞液按你的浓度加入台盼兰置室温5分钟左右； 3、准备好洁净的计数板及盖玻片放在一旁，用玻璃滴管吸取染好并轻轻吹匀的细胞液，将滴管尖端轻轻靠在盖玻与计数板的缝隙间，微微捏一下滴管胶头细胞自动就被吸到计数板里了（捏重了细胞不均匀，计数不准，细胞还会流出）。 4、在镜下计数。 四角的4个大方格内细胞总数÷4×10000=你滴入时细胞液每ml的细胞数 一般来说，如果你培养的细胞是贴壁生长的话，去除旧的培养基后，不管是直接加入新鲜培养基吹打（细胞易脱落），还是在胰酶消化后用新鲜培养基吹打，都可不用台盼兰染色，因为，死的细胞都掉落在旧培养基里，而活的细胞则贴在壁上。如果细胞是悬浮生长的，则需要用台盼兰染色。不要担心计数不准，因为你可以将染色液的体积换算回去呀。比如0.1ml细胞悬液加0.1ml台盼兰，在EP管内混匀后计数，计数完的细胞数×2不就还原了吗。你在计数板中看到的亮点就是细胞，当细胞单个悬浮时，光的通透性就强一些，而细胞成片贴壁时，细胞就暗一些，是正常的。